DNA连接酶不需要模板，因为DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。用DNA连接酶连接具互补粘性末端的DNA1片段或是用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA1片段连接起来。
DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链。DNA聚合酶的结构是三磷酸腺苷。
制备互补DNA，往往需要先分离从目的***转录来的mRNA.如果该***编码的蛋白质是细胞中的主要蛋白质，则此***的产物是总mRNA的主要组成部分 。就胰岛B细胞而论，此细胞含有高水平胰岛素前体mRNA，后者有时可以沉淀正在翻译的mRNA的核糖核蛋白体，如果用特异结合所表达的蛋白质(抗原)，则可从沉淀的核糖体中分离出胰岛素特异的mRNA，一般特异mRNA只是细胞总mRNA中的次要成分。在这种情况下，不得不以密度梯度离心，按分子量大小把总mRNA分开，然后把分离开的mRNA直接用于试管中表达蛋白质(用家兔网织细胞的溶胞产物或小麦胚芽提取物作为翻译系统的诱导物)再用沉淀或聚酰胺凝胶电泳从许多表达的蛋白中测定出目的蛋白，从而确定表达该蛋白的特异mRNA。
置换合成法。该方法利用链在反转录酶作用下产生的DNA RNA杂交链不用碱变性，DNA连接酶，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物。在大肠DNA聚合酶工的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点：①非常有效；②直接利用链反应产物，无须进一步处理和纯化；③不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。
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