探针法定量***-友名生物公司

原位PCR( in situ PCR)技术

原位PCR综合了PCR和原位杂交( Insitu hybridization， ISH)的优点是一种在***切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增.再用特异性的探针原位杂交检测。原位PCR标本一般需先经化学固定，以保持***细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜有一定的通透性，PCR扩增所需的各种成分可进入细胞内或核内。在原位对特定的DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织，不易透过细胞膜向外弥散，故保留在原位。这样就很容易应用ISH将其检出，同时还可对目的DNA序列的***细胞进行形态学分析。

PCR的创建

Khorana (1971)等***早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA***。”但由于当时***序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上分子克1隆技术的出现提供了一种克1隆和扩增***的途径，所以Khorana的设想被人们遗忘了。

1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上，猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第yi个PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。

1985年10月25日申请了PCR的专1利，

1987年7月28日批准（专1利号4，683，202 ），Mullis是第yi个发明人；

1985年12月20日在Science杂志上发表了第yi篇PCR的学术论1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。

PCR引物设计的基本原则

引物长度：15-30bp，探针法定量***，常用为20bp左右。

引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC建议随机分布，避免5个以上的piao呤或嘧1啶核苷酸的成串排列参照。

引物内部不应出现互补序列。

两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，

引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3‘端的碱基，特别是***末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，***佳选择是G和C。

引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地1高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。