错位切割含目的***的DNA部分片段和运载体一形成黏性末端
单酶切：同一种限制酶分别切割含目的***DNA部分片段与运载体。这是较简单的一种方法，含目的***的DNA部分片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。
用同裂酶去切割含目的***DNA部分片段与运载体。有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶(同切酶或异源同工酶)。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。
DNA部分片段的连接
DNA部分片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4 DNA连接酶连接( 5′末端浓度为0.1-1.0 μM)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3′和 5′末端都保留完整，连接反应才会发生;而且只有那些识别位点完全***的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3′和 5′末端都是完整的，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。
限制性内切酶已有百余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg+2来激1活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg+2外，还需ATP 等其他辅助因子的激1活;切割位点和识别序列间的距离不同;有的内切酶同时具有甲1基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为I、II 和III 种类型。II 型限制性内切酶只需要二价镁离子的激1活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA部分片段具有相同的末端结构，而且大多数的II 型酶可提供粘性未端，快切酶，有利于片段再连接，大部分II 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称之回文结构。如EcoRI 和HindIII 的识别和切口分别为：
EcoRI ： G ↓AATT C HindIII ： A↓AGCT T
T TCGA↑ A C TTAA↑G
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