RNA扩增***盒-友名生物技术(图)

巢式PCR(NEST PCR枝术.

先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量.然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带。此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少 巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少。同时在第yi次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度。这样在第yi次PCR时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物，经过若干次循环。待外引物基本消耗尽，无需取出第yi次PCR产物，只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤。同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in，RNA扩增***盒， drop-out PCR)上述三种方法主要用于少量DNA模板的扩增。

 PCR技术的基本原理

PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下.依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶.促合成反应。其具体反应分三步:变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一 循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的copy，经25~ 30次循环DNA数量可达2x1067拷贝数。

锚定PCR(Anchored PCR. APCR技术.

用酶法在一通用引物反转录cDNA3"-末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增，称为APCR.应用:它可用于扩增未知或全知序列，如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

PCR法不仅仅局限于分子生物学，还因其简便、迅速等特点被广泛应用于***、法***、食品、环境卫生检验、动植物检验等其它领域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。

1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反应有时会出现错配 (Misincorporation) 现象，因而PCR克1隆、变异导入等实验中，需加以注意。

2. 扩增的DNA长度：使用Taq DNA Polymerase进行PCR扩增时，通常可扩增几kb的DNA，超过10 kb则比较困难。这就给利用PCR进行Mapping等Genome解析带来麻烦。

3. 扩增量：使用Taq DNA Polymerase进行PCR产物克1隆及食品、环境卫生检验等时，扩增量常常达不到要求。为解决以上难题，Takara在对Polymerase、Buffer及反应条件等进行深入研究的基础上，开发了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术，运用此技术可大量正确地扩增长达40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技术扩展了PCR的应用范围，可在Genome解析、***诊断、长片段 DNA的克1隆及变异导入等方面发挥优势。