folin―酚***法早先是由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生***学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要准确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、***铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),***纳(1%),NaNO浓度(1%),TCA(0.5%),乙醇(5%),***H10O(5%),CH3COCH3(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,BCA蛋白质定量***,必须作校正曲线。含***铵的溶液,只须加浓碳酸钠―NaOH溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠―NaOH溶液的浓度1~2倍。
蛋白质含量测定操作方法
1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲***。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的首支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
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