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DEAE-葡聚糖转染法
DEAE-葡聚糖转染法的原理时带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成复合物通过细胞内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核。此法只适合瞬时转染实验,转染效率与DEAE-葡聚糖的浓度以及细胞与DNA/EDAE-葡聚糖混合液接触时间的长短有关,可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间(0.5-1.5h),也可用较低浓度(250mg/L)的DEAE-葡聚糖坐拥较长时间(8h)。
1. 将上述复合物直接加入到细胞培养基中,轻摇细胞板或用加样器吸打混匀。备注:转染复合物可直接加入含血0清的细胞培养基中进行转染。在极0少情况下会出现贴壁细胞脱落现象,可先从待转染细胞孔中吸取 500μl 培养基与转染复合物预混后再加入细胞中。若在细胞瓶中进行转染,直接加入到无细胞贴壁的对面或侧面并摇匀即可。
2. 将细胞板移至 37oC/5% CO2 孵箱中进行培养。备注:无需在转染后 4~6 小时补加血0清或更换培养基。
3. 24~72 小时后根据实验需要进行瞬时表达分析或稳定细胞系加压筛选。
已有众多的文献报道,脂质体本身会参与细胞生理活动,脂质体转染***,引起***表达的上调或下调。如参与PKC(蛋白激酶C)通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30);如***ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777(4):362-8);如与线粒体膜发生作用(J Biol Chem. 1989 Jan 25;264(3):1508-15);转染siRNA造成脱靶效应等等。细胞毒性的大小往往意味着对细胞生理活动影响的大小,脂质体这些作用是造成细胞毒性的根本原因。这会对相关研究数据产生严重的干扰,甚至影响研究的结论。这已引起了许多研究者的注意。
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