台州pcr-英瀚斯-pcr实验室

18.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，pcr实验室，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，PCR，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5"端避免使用G。

◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在 68-70C   左右。

有用的荧光染料参数

线粒体测序

线粒体是真核生物的重要细胞器，是生物体的能量工厂，参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动，对生物的生理活动起着至关重要的作用。大部分线粒体***由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点，被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、***诊断等学科领域。线粒体全***组在生物进化的研究中具有的优势。由于线粒体有着与真核生物长期共生的进化历史，因此其***组包含了反映物种进化的关键信息，同时，相对于核***组，线粒体***组小，容易对大量物种进行横向的比较分析，有利于生物进化的研究，因而受到进化生物学家的钟爱。线粒体的组成可以从两个层面上反映物种及群体的遗传和进化，即核酸序列组成和***组的结构特征，两者的特征具有不同的进化机制和进化速度，在进化生物学研究中可以很好的互补。

聚合酶链式反应(PCR)

操作步骤

1.在冰浴中，台州pcr，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddH2O至

μl 50

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C

预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ，循环30-35

次，后在72°C保温7min。

3.结束反应，***检测多少钱， PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。

4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，以

除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。