1、细胞准备:细胞传到后,成都pcr,密度达到70%左右时进行转染;
2、细胞转染:取两个EP管,一个加入Opti-MEM、质粒和包装质粒;另一个加入Opti-MEM、lipo2000,然后将两管混匀;
3、细胞孵育:将混合液逐滴加入细胞培养皿中,混匀后孵育;
4、收集病毒:转染后48h、72h收集含慢病毒的上清;
5、滴度检测:细胞为30%-50%时加入病毒上清液,检测阳性细胞比例。
microRNA芯片:
RNA干扰(RNA Interference, RNAi)现象是一种进化上保守的抵御或外来病毒qin犯的防御机制。将含有靶***mRNA同源互补序列的RNA(Double strand RNA, dsRNA)导入细胞后,能够特异地识别该mRNA,引起mRNA的降解,从而导致相应的功能缺失。RNAi提供了一种经济、快捷、gao效的***特异***表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究***功能和chuan染性***及恶xingzhong瘤***zhi疗领域。目前常用的RNA干扰手段为miRNA、 shRNA和siRNA等。
MiRNA是一类可以通过RNAi机制调节***表达的内源性小RNA,实时定量pcr,人工miRNA与shRNA的设计原理基本相同,由于miRNA具有内源性,因此其更易产生有效的***沉默。
技术流程:
dsRNA或pre-miRNA被导入细胞后,***检测怎么做,能够被一种特异的核酸内切酶(Dicer)识别并切割成为小片段,这些片段在RNA解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-Induced Silencing Complex,RISC),RISC与mRNA同源区进行特异性结合,若miRNA与mRNA的结合位点配对,则切割mRNA;若miRNA与mRNA的结合位点不配对,则***mRNA的翻译。
25.PCR扩增不出就引物有问题吗?
答:基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的***片段。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见:
(1) RT-PCR。请注意,很多***通过常规RT -PCR方法是很难扩增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标***在特定***和细胞中含量。
(2)从***组中扩增。一般情况下,dna检测,***在***组中都是单拷贝,***组作为模板需要严格控制用量。***组DNA过高,会影响反应体系中的Mg和pH
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